细胞株构建

细胞稳转株构建方法有哪些？稳定细胞株的构建流程是怎样的？

在生命科学领域，稳定细胞株的构建是非常重要的技术之一。稳定细胞株是一种被修改的细胞系，具有特定的基因表达模式和功能，因此具有许多应用前景，例如基因功能的研究和蛋白质生产等。本文将介绍细胞稳转株构建的方法和流程。
构建稳定细胞株有两种主要方式，一种是使用病毒载体介导的基因递送，另一种是利用质粒转染。使用病毒介导的基因递送通常会导致细胞的死亡或转化，因此它不适用于需要形成稳定表达的蛋白质的应用。因此，本文将重点介绍利用质粒转染构建细胞稳转株的方法。
1. 选择合适的细胞系
在开始构建稳定细胞株之前，需要选择合适的细胞系。一般来说，常用的细胞系有293、HeLa和CHO等。在选择细胞系时，需要考虑到其易于培养和转染等因素。此外，还要和实验室的其他研究项目协调，以确保所选择的细胞系适合于研究计划。
2. 选择合适的质粒载体
质粒序列是构建细胞稳转株的基础。一般来说，在选择质粒载体时，需要考虑到以下几个因素：
(1) 选择带有适当的选择标记基因的质粒，以便筛选得到稳定转染的细胞。
(2) 选择带有高效表达启动子的质粒，以确保转录的效率。
(3) 选择带有正确的多聚体信号（PolyA）序列的质粒，以确保转录末端处理正确。
在选择质粒时，还需要注意其易于制备和纯化的程度，以确保所构建的稳定细胞株是高质量的。
3. 质粒转染
质粒转染是构建稳定细胞株的关键步骤，这也是该技术选择的优势之一。质粒转染可以通过多种途径实现，例如电穿孔法、钙磷转染法或利用交联剂等。对于小规模实验，利用商业化转染试剂进行转染也是一种方便、快捷的方法。
4. 筛选和扩展细胞
转染完成后，需要筛选转染后稳定表达所需基因的细胞。通常使用特定的筛选方法，例如使用特定的抗生素来筛选具有选择标记基因的细胞，以确保只有稳定转染的细胞才得以存活和扩展。
5. 验证细胞稳定性和表达
在细胞筛选和扩展完成后，需要验证构建的细胞稳定性和表达情况。这可以通过多种方法实现，例如荧光染色、Western blotting等。通过这些方法，可以确定哪些细胞具有稳定的基因表达，并选择这些稳定细胞株用于后续的研究应用。
总之，细胞稳转株的构建是一项困难但非常重要的技术，在基因功能研究和蛋白质生产等领域具有广泛的应用前景。上述方法提供了构建稳定细胞株的主要步骤和流程，希望能够对相关研究者提供帮助。

如何构建稳定细胞株？

构建方法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。扩展资料：一般流程1、筛选浓度测定：以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；2、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；3、细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6 ）；4、利用质粒上含有的抗性选择进行筛选；5、鉴定筛选结果。参考资料：百度百科-细胞株百度百科-稳定细胞系

稳定细胞株的构建流程?

构建稳定细胞株是一种常用的实验技术，用于长期表达特定蛋白质或进行功能研究。下面是一般的稳定细胞株构建流程：稳转细胞株构建选择宿主细胞系：选择能够稳定承载外源基因的细胞系作为宿主细胞。常用的细胞系包括HEK293、CHO、HeLa等。构建表达载体：设计和构建包含目标基因的表达载体。在载体中通常包括启动子、选择标记基因（例如抗生素抗性基因）以及目标基因的编码序列。转染：将表达载体转染到宿主细胞中。可以使用多种转染方法，如化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染等。选择筛选：在转染后添加相应的选择压（例如抗生素），以筛选出已成功集成表达载体的细胞。通常会对细胞进行适当的稀释，以确保每个克隆细胞单元可以正常生长。单克隆筛选：从筛选后的细胞中挑选出单个细胞克隆。可以使用稀释法或限稀稀释法在96孔板或384孔板中进行单克隆落座。鉴定：对单克隆细胞进行筛选和鉴定，确认是否成功集成目标基因。常用的鉴定方法包括PCR、Western blot、荧光显微镜观察等。扩增和冻存：从鉴定合格的单克隆细胞中选择合适的克隆，进行细胞扩增，保存备份细胞，并进行冻存以便后续实验使用。长期维持：定期传代和培养稳定细胞株以维持其稳定表达目标基因的特性。同时，必要时进行对稳定细胞株的验证和鉴定。在每个步骤中都要注意操作条件、培养基、培养条件和实验室安全等因素，以确保稳定细胞株的成功构建。具体的流程和条件可能因实验目的、细胞系和载体设计等因素而有所不同。因此，在实施之前，最好参考相关文献和经验，并根据实际情况进行优化和调整。

如何构建耐药细胞株？

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是肿瘤治疗失败的重要因素之一，成为目前阻碍肿瘤治疗的绊脚石。因此，探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点和难点。

肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。

一种药物长期作用于某类细胞，杀死其中没有抗性的细胞，而对这类细胞中具有抗性的细胞不能杀死，即进行了选择。具有抗性的细胞大量繁殖产生很多抗性后代，但再用这种药物时表现出的药效大大下降的现象就是细胞的耐药性，采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性，从而构建出对特定药物产生耐药性的肿瘤细胞株。

细胞与低剂量的药物长期接触，引起细胞本身药物化学过程的改变，细胞膜上出现Pgp糖蛋白，使细胞逐渐对药物耐受，随着药物浓度的递增，其耐受程度逐渐加强。

A.  检测亲本细胞株的IC50

IC50(half maximal inhibitory concentration),即半抑制浓度,指某一种物质对某些生物程序抑制达到50%抑制效果时的浓度。对细胞增殖方面,可以理解为对细胞增殖的抑制效果达到细胞正常增殖水平50%时的药物浓度。通常用IC50来衡量药物对细胞的毒性或者细胞对药物的耐受能力,在药物实验中,常用IC50来评估实验中使用的药物浓度。IC50的计算方法很多,常用的有Excel、graphpad prism、SPSS等。

B.  药物浓度递增法/大剂量药物冲击法

1) 大剂量药物冲击法： 将处于对数生长期的肿瘤细胞（汇合度60%-80%）置于含有浓度的药物浓度的培养液中培养，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，常规培养，待细胞恢复生长，培养一段时间后重复上述操作，将筛选出的细胞在一定浓度的药物浓度培养液中继续培养依这样不断改变作用时间，共经过1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10个作用时间段，约6-8个月的培养，最终使得细胞能够在一定浓度的药物的培养液中持续稳定生长并传代，然后脱药培养1个月在检测细胞的生物特性及耐药指标。

大剂量药物冲击法优点是与临床上大剂量化疗药物冲击的治疗方式相接近，但是缺点在于大剂量药物冲击法的药物浓度很高，细胞培养由于外环境骤变，细胞可能难以耐受，细胞状态较难控制，且耐药性能不稳定。

2) 药物浓度递增法： 取处于对数生长期的肿瘤细胞（汇合度60%-80%），加入起始浓度为低浓度（建议为亲本细胞株的IC50的1/10-1/5）的药物作用24h，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，细胞恢复生长后，消化传代复以低浓度作用细胞24h，待细胞增殖至正常形态后，重复上述药物冲击，每种浓度冲击6-8次。待细胞在此浓度稳定生长后，提高药物浓度继续培养，药物依次递增浓度加药。药物诱导历时6-8个月，直到细胞能够在浓度的药物中稳定生长。

药物浓度递增法优点在于诱导耐药细胞的药物剂量循序渐进，细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，缺点在于诱导耐药过程耗时很长，且其化疗药物的作用方式与临床上化疗药物大剂量短疗程的化疗原则存在一定的差异；

C.  检测耐药细胞株的IC50　

检测耐药细胞株的IC50，根据IC50值计算出耐药指数（resistanceindex, RI），RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50，RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。

我将为您带来最新的相关报道以及技术干货，并可以为您提供所有基因编辑的相关服务！

如何建耐药细胞株？

一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。
脂质体转染：在转染24小时后，消化细胞并计数。将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。筛选时间和浓度视细胞而定。一般G418一个星期作用，嘌呤霉素2-3天。
脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。
病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
病毒转染得到稳定细胞株的效率高，只是步骤繁琐。
现在很多家公司提供构建稳定细胞株的技术服务，如杭州的波因，南京的凯基等，可以提供各种载体的构建及细胞株的构建整套技术服务。

原代的细胞到底能不能够构建稳定的细胞株呢？

原代细胞要建立稳定的细胞系，必须满足一定的条件。转染24小时后，细胞消化计数。将细胞植入96孔板，保证每孔2-3个细胞。细胞贴壁后，加入抗生素进行筛选。筛选时间和浓度取决于细胞。一般来说，G418起效一周，嘌呤2-3天。脂质体单克隆抗体筛选时间长，效率仅为1%左右。病毒转染，首先包装细胞，通常是293个细胞，包装病毒，然后用病毒转染靶细胞。包装病毒取决于不同类型的病毒，一般需要3-5天。测定包装病毒的滴度，根据滴度确定病毒转染靶细胞的量。转染后1-2天用抗生素筛选稳定的细胞株。转染效率高，但步骤复杂。目前，许多公司为稳定细胞系的构建提供技术服务，如杭州博恩、南京凯基等。它们可以为各种载体和细胞系的构建提供一整套技术服务。脂质体转染后克隆筛选出稳定的细胞株。二是通过逆转录病毒和慢病毒转染筛选稳定的细胞株。它可以通过蛋白酶或其他方法从人体组织中获得，如小鼠组织、大鼠组织、兔组织等，称为原代细胞。一般认为，在第一代培养的原代细胞和转移到第十代的细胞统称为原代细胞培养。使原代细胞在人工条件下存活、生长、增殖和转移，研究细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题。通过选择或克隆形成方法从原代培养细胞中获得具有特殊性质的细胞或标记物称为细胞系。一般认为细胞系是单个细胞通过分离培养或筛选而形成的细胞群。总而言之，实验环境稳定，温度适宜，原代细胞健康。在满足这些条件后，再等待一段时间，即可进行栽培，这样才可以构建稳定的细胞株。

原代细胞构建稳定细胞株需要什么条件？

转染 24 小时后，细胞被消化并计数。将细胞植入 96 孔板中，以确保每孔 2－3 个细胞，从而获得单克隆。细胞粘附在壁上后，添加抗生素进行筛选。筛选时间和浓度取决于细胞。通常，G418 生效一周，嘌呤 2－3 天。脂质体单克隆的筛选时间长且效率低，仅约 1％。病毒转染， 首先包装细胞，通常是 293 个细胞，以包装病毒，然后用病毒转染靶细胞。包装病毒取决于不同类型的病毒，一般需要 3－5 天，应测量包装病毒的滴度，并根据滴度确定转染靶细胞的病毒量，在转染靶细胞后 1－2 天，通过抗生素筛选稳定的细胞系。转染获得稳定细胞系的效率高，但步骤繁琐。目前，许多公司提供构建稳定细胞系的技术服务，如杭州那边的波因，南京的凯基那样，他们可以为各种载体和细胞系的构建提供一整套技术服务。它是脂质体转染后克隆和筛选的稳定细胞系，另一种是利用逆转录病毒和慢病毒转染来筛选稳定的细胞系，通过蛋白酶或其他方法从人体组织，如人体组织里面的小鼠组织，大鼠组织，兔组织等， 和体外模拟体培养获得的细胞，他们被称为原代细胞，一般认为第一代培养的原代细胞和传给第 10 代的细胞统称为原代细胞培养。使其原代细胞在人工条件下存活，生长，繁殖和传递，研究细胞生命过程，细胞癌变，细胞工程等问题。通过选择方法或克隆形成方法从原代培养细胞中获得的具有特殊性质的细胞或标记物称为细胞系，一般认为，细胞系是通过单细胞隔离培养或筛选，由单细胞增殖形成的细胞群。

什么是原代细胞，细胞株，细胞系

什么是原代细胞，细胞株，细胞系
原代培养 通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，